到了復(fù)蘇細(xì)胞開(kāi)始實(shí)驗(yàn)的環(huán)節(jié)了 ，以下是整理的一些復(fù)蘇細(xì)胞的注意事項(xiàng)：

1. 細(xì)胞儲(chǔ)存在液氮中，溫度達(dá)-196℃，理論上儲(chǔ)存時(shí)間是無(wú)限的。只要一直在液氮，凍存沒(méi)有問(wèn)題，那么復(fù)蘇也不會(huì)出現(xiàn)很大的問(wèn)題，不存在有效期限，細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融，復(fù)蘇一定越快越好，實(shí)驗(yàn)證明這樣可以最大限度的保存細(xì)胞活力。

2. 取細(xì)胞時(shí)應(yīng)做好防護(hù)措施，帶好防凍手套，護(hù)目鏡。細(xì)胞凍存管可能漏入液氮，解凍時(shí)凍存管中的氣溫急劇上升，可導(dǎo)致爆炸。

3. 必須在1-2min內(nèi)使凍存液*融化，復(fù)蘇溫度太慢，會(huì)造成細(xì)胞的損傷。如果凍存管的壁較厚，隔熱效果較好，可以適當(dāng)提高水浴溫度（37℃~40℃）。凍存液建議選用進(jìn)口產(chǎn)品，DMSO含量為5%,并添加海藻糖和丙二醇以及細(xì)胞生長(zhǎng)因子，細(xì)胞成活更高.

4. 提前預(yù)定超凈臺(tái)，減少?gòu)?fù)蘇后插在冰盒里等待的時(shí)間。復(fù)蘇后若需要長(zhǎng)時(shí)間（>1h）等待，建議往離心管加15ml以上培養(yǎng)基搖勻以稀釋DMSO給細(xì)胞帶來(lái)的毒性作用。對(duì)于不離心直接加入培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞，培養(yǎng)基的加入量是個(gè)需要考慮的問(wèn)題。主要涉及DMSO的濃度，一般DMSO含量為5%的細(xì)胞，在7.5ml的*培養(yǎng)基里不受影響，細(xì)胞可正常生長(zhǎng)（這招很管用哦）。

5. 關(guān)于細(xì)胞溶解后，是否需要離心的問(wèn)題，需要根據(jù)特定的細(xì)胞情況而定。主要有兩種方式。一種是解凍后的細(xì)胞懸液直接吹打均勻后分裝到培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，第二天換液（后貼壁后即換液）。因?yàn)殡x心的目的是兩個(gè)，去除DMSO，去除死細(xì)胞，這個(gè)是標(biāo)準(zhǔn)流程。但對(duì)一般人來(lái)說(shuō)，把握不好離心轉(zhuǎn)速和時(shí)間，轉(zhuǎn)的不夠活細(xì)胞沉底的少，細(xì)胞就全被扔掉了，轉(zhuǎn)過(guò)了活細(xì)胞會(huì)受壓過(guò)大，死亡。此外在操作過(guò)程中容易污染。另一種是須離心后，將凍存液倒干凈，且一定要倒干凈。懸浮細(xì)胞和貼壁比較慢的細(xì)胞一定要離心，比如NCI-H716,和LNCAP等特殊培養(yǎng)方式的細(xì)胞。

6. 有些細(xì)胞復(fù)蘇后一星期才有起色，切忌要有耐心，不要換液，耐心等待，兩周后再做決定。不要復(fù)蘇三四天后，細(xì)胞沒(méi)有任何動(dòng)靜，認(rèn)為失敗，倒掉所有細(xì)胞。MLO-Y4就有這種毛病，技術(shù)復(fù)蘇后各種花式優(yōu)待它就是不長(zhǎng)，然后大家都不想理它了，放了一周多拿出來(lái)，竟然長(zhǎng)滿了。